Primární hemostáza je proces charakterizovaný výstavbou primární cévní zátky, které vede k zacelení porušené integrity cévy, ať už z důvodu jejího poranění nebo porušení její integrity z jiných důvodů. Hlavními aktéry v tomto procesu jsou trombocyty. Jejich dostatečný počet a funkčnost je pro tento proces nezbytná. Změny v počtu trombocytů a jejich morfologii lze zjistit pomocí základního vyšetření krevního obrazu. Jedním z postupů, jak si ověřit jejich funkčnost v primární hemostáze je testování jejich schopnosti agregace.

Proces tvorby primární zátky lze rozdělit na fázi adheze, agregace a retrakce.

V adhezi trombocytů hrají důležitou roli povrchové glykoproteiny (Gp) trombocytů, které mají afinitu k molekulám, které se uvolňují z poraněné tkáně, jako například kolagen. Při poranění endotelu cévy se odhalí vlákna kolagenu, ke kterým má vysokou afinitu von Willebrandův faktor (vWF), který zprostředkuje vazbu kolagenu z endotelu a Gp Ib trombocytů. Tato vazba „lokalizuje“ trombocyty v místě poranění a následně dojde k přímé vazbě GpVI a GpIa/IIa ke kolagenu. Trombocyty se aktivují, uvolňují molekuly uložené v α a denzních granulích  trombocytů, především ADP a fibrinogen a mění svůj tvar na amébovitý. Uvolnění aktivních molekul z trombocytů vede k jejich další aktivaci. Na povrchu exprimují glykoproteiny GpIIb/IIIa, které umožní jejich vzájemnou agregaci a dochází k tzv. flip-flop fenoménu („ převrácení“ plazmatické membrány trombocytů a vystavení negativně nabitých fosfolipidů pro proces koagulace). Ve fázi retrakce se primární zátka smrští a společně s probíhající tvorbou fibrinových vláken tak upevní trombus v místě poranění.

Obrázek č. 1: Struktura trombocytu (zdroj: http://passtheclassandnotfail.blogspot.cz)

Obrázek č. 2.: Receptory trombocytů aktivní v procesu primární hemostázy (zdroj: http://www.nature.com/nrd/journal/v2/n10/full/nrd1198.html)

Zlatým standardem v testování agregagability trombocytů patrí Bornova optická agregometrie. Využívá se plazma chudá na trombocyty (PPP) a plazma bohatá na trombocyty (PRP). Pomocí PPP se nekalibruje agregometr (100% agregace) a umožní naředění získané PRP na požadovanou koncentraci trombocytů (250 ± 50.10⁹/l).

Do jednotlivých agregačních kyvet se pak nadávkuje naředěná PRP a po přídavku jednotlivých induktorů se sleduje záznam agregace. Přístroj vydává jako výsledek procento maximální agregace (MA) po cca 15 minutovém měření. U některých induktorů (ADP, adrenalin) dochází po primární vlně agregace k sekundární vlně agregace (po potřebném impulzu, jako je uvolnění tromboxanu A2, ADP). Absence sekundární vlny, resp. vysoká míra desagregace, může svědčit pro poruchu v uvolňovací reakci, pro poruchu v zásobních granulích trombocytů, nebo pochybení v preanalytické fázi (pacient užívá interferující léky)1. Míru desagregace se sledujeme pouze u induktoru ADP¹.

Obr. č. 3.: Grafický záznam agregace (zdroj: www.practical-haemostasis.com)

U pacienta lze v porovnání s kontrolním vzorkem od zdravé osoby pozorovat po jednotlivých induktorech (induktory jsou, uvedené nad každou křivkou) pouze první vlnu agregace a u ristocetinu slabší odezvu. Výsledek vyšetření poukazuje na poruchu v uvolňovací reakci, která je pro agregaci destiček velmi důležitá (dochází k uvolnění ADP, trombospondinu a dalších působků z granulí destiček).

Induktory agregace

Použitím vhodné kombinace induktorů lze identifikovat a odlišit jednotlivé defekty v procesu agregace trombocytů. Nejčastěji používané induktory patří ADP, AA, adrenalin, ristocetin, kolagen a trombin.

ADP

Jedná se o slabý induktor agregace, jehož vazba na receptor P2Y1 vede ke změně tvaru trombocytu a uvolnění intracelulárního kalcia a ADP z granulí. Vazba uvolněného ADP na druhý receptor – P2Y12 vede k sekundární agregaci a reflektuje efektivitu sekrece aktivních látek z granulí trombocytů. Sledování agregace trombocytů po přídavku ADP je vhodnou metodou ke sledování účinnosti protidestičkové terapie thienopyridiny. Léčba ASA a nesteroidními protizánětlivými léky (Ibalgin) inhibuje druhou vlnu agregace vyvolanou ADP.

Kyselina arachidonová (AA)

AA je prekurzorem tromboxanu A2 (TXA2) v trombocytech. TXA2 je silný induktor agregace, způsobuje uvolnění aktivních látek z trombocytů, zvýšenou tvorbu TXA2 a aktivaci Gp IIb/IIIa. Agregačním vyšetřením s použitím AA je možné sledovat efekt protidestičkové léčby ASA.

Adrenalin (epinefrin)

Tento slabý induktor agregace se váže na α₂ adrenergní receptory, které vedou k uvolnění intracelulárního kalcia, uvolnění ADP a následně k druhé vlně agregace. Sníženou agregaci po přídavku adrenalinu můžeme sledovat u léčby ASA a nesteroidními protizánětlivými léky.

Ristocetin

Ristocetin je antibiotikum, které indukuje aglutinaci trombocytů pomocí vazby vWF a Gp Ib/V/IX. Nedostatečná aglutinace po přídavku ristocetinu se může objevit u Bernard – Soulierova syndromu, nebo von Willebrandovy nemoci. Mechanizmus jednotlivých onemocnění je jiný, k určení přesné diagnózy jsou nutná další vyšetření.

Kolagen

Vazba trombocytů na kolagen je důležitá především v první fázi primární hemostázy, tedy v adhezi. Kolagen se váže na Gp Ia/IIa, jeho následná vazba na Gp VI vede k aktivaci a tvorbě TXA2.

Trombin

Trombin je nejsilnějším induktorem agregace destiček, váže se na receptory PAR1 a PAR4. Již v koncentraci 100 nmol/l způsobí u fyziologických trombocytů plnou agregaci. V laboratoři OKH tento induktor nepoužíváme.

Funkční poruchy trombocytů

Bernardův – Soulierův syndrom

Příčinou tohoto syndromu je defekt komplexu Gp Ib/V/IX, který vede k neschopnosti destiček vázat  vWF, čímž je negativně ovlivněn proces adheze. Toto onemocnění může vést až k život ohrožujícím krvácivým stavům. V laboratorních testech nacházíme v nátěru periferní krve obří destičky, doba krvácivosti je prodloužená a i přes normální hodnoty vWF je patologická agregační odezva destiček po ristocetinu. Léčba je možná pouze symptomatická – protikrvácivá, onemocnění je vrozené.

Glanzmannova – Naegeliho tromboastenie

Toto vzácné vrozené onemocnění je doprovázeno poruchou agregace a retrakce trombocytů. Příčinou funkční poruchy je defekt Gp IIb/IIIa, který za normálních okolností váže fibrinogen a umožňuje agregaci destiček. V počtu trombocytů ani v jejich morfologii nejsou patrné patologie, ty lze odhalit při funkčním vyšetření agregace destiček, kdy chybí agregační odpověď po ADP, kolagenu, AA, adrenalinu a trombinu. Existuji 3 varianty tohoto onemocnění, které se liší množstvím komplexů Gp IIb/IIIa na povrchu trombocytů, resp. jejich funkčností.

Porucha skladovacích granulí a uvolňovací reakce

Jedná se o skupinu vrozených poruch, které mají společné některé laboratorní parametry – prodloužená doba krvácivosti, porucha agregace destiček po kolagenu a AA, první vlna agregace po ADP je normální a sekundární chybí, nebo je patologická. Existuji dvě formy poruchy.

·         SPD (storage pool disease = porucha skladovacích granulí) – chybí denzní a/nebo α granula, resp. je obsah proagregačních látek v granulích snížen. Do této skupiny se řadí Heřmanského-Pudlákův syndrom, Chediakův-Higashiho syndrom, Wiskottův-Aldrichův syndrom, gray platelet syndrome = syndrom šedých destiček,

·         Aspirin like disease - jde o onemocnění způsobené poruchou uvolňování aktivních látek z granulomeru destiček. Rovněž je postižen cyklus metabolismu kyseliny arachidonové a cyklických enteroperoxidů.

Porucha prokoagulační aktivity destiček – Scottův syndrom

Porucha se neprojevuje v adhezi, agregaci, retrakci, sekreci nebo morfologii destiček, ale v jejich prokoagulační aktivitě. Výsledkem je snížení generace trombinu a na destičkách závislé tvorby fibrinu na cévním endotelu.9,12

Destičkový typ vWCH

Příčinou této trombocytopatie je mutace v genu pro Gp Ib, způsobující jeho zvýšenou afinitu pro vWF, vedoucí k deficitu multimerů vWF v plazmě. Je doprovázen krvácivými projevy.

Syndrom lepivých destiček (SPS)

SPS je dědičný defekt trombocytů, spojený s arteriálními nebo venózními tromboembolickými příhodami. Za patologickou hyperagregabilitu destiček jsou podle dostupných studii odpovědné receptory Gp Ia/IIa a Gp IIb/IIIa.

Rozlišujeme 3 typy SPS:

·         typ I, kdy lze pozorovat hypeagregabilitu po přídavku ADP a epinefrinu,

·         typ II s hyperagregační odpovědí pouze po přídavku epinefrinu,

·         typ III je typický hyperagregabilitou po indukci ADP.

Vyšetření na SPS by mělo být provedeno u pacientů po infarktu myokardu, u DIC, při migrénách nebo problémech v těhotenství, před transplantací ledvin apod. Léčebný postup využívá pouze nízké dávky ASA, běžná antikoagulancia jsou neúčinná.

Použitá literatura:

1.      http://www.practical-haemostasis.com,

2.    PENKA, Miroslav a Alena BULIKOVÁ. Neonkologická hematologie. 2., dopl. a zcela přeprac. vyd. Praha: Grada, 2009,

3.    PECKA, Miroslav. Laboratorní hematologie v přehledu: fyziologie a patofyziologie hemostázy. Český Těšín: FINIDR, 2004,

4.    Smejkal P, M. Matýšková, M. Penka. Von Willebrandova choroba. Vnitř Lék 2008; 54(3): 257 – 264,

5.    PECKA, Miroslav a Milan BLÁHA. Praktická hematologie: laboratorní metody. Český Těšín: Infiniti art, 2010.

6.      MÜHLFELD, A. S., M. KETTELER, K. SCHWAMBORN, F. EITNER, B. SCHNEIDER, U. GLADZIWA, R. KNÜCHEL a J. FLOEGE. Sticky Platelet Syndrome: An Underrecognized Cause of Graft Dysfunction and Thromboembolic Complications in Renal Transplant Recipients. American Journal of Transplantation [online]. 2007, 7(7), 1865-1868.